6 抽样 

按每一发酵罐菌液制成的产品为一批，按批抽样检验。抽样过程要严格避免杂菌污染。6.1 抽样工具及用品 

抽样前预先准备好无菌塑料袋(或塑料瓶)、金属勺、剪刀、封口机(或封口胶带)、牛皮纸封样袋、标签、抽样封条和胶水。 

6.2 抽样数量及抽样方法 

在成品库抽样，按“”形分层设点抽样，抽样以件为单位，小包装产品以一包装箱为一件。大包装（30-50kg）产品以一袋（或一桶）为一件。抽样基数由样品基数的大小确定。1-10件，全部抽样。11-200件，抽样10件；201-400件，抽取20件。样品基数大于400件，按照超过部分的2%增加抽样件数。总件数不超过40件。

每件小包装产品抽取一小袋，在无菌条件下每袋取样200g。将所有样品混匀，按四分法缩到2000g，分装4袋，然后封口。每2袋为一份装入牛皮纸封样袋。最后贴上抽样标签和抽样封条（液体根瘤菌肥小包装产品抽样参照此法进行）。所抽样品一份留存被抽样单位，一份交检测中心检测。

7  检验方法 

7.1 仪器设备及试剂 

7.1.1 仪器设备 

生物显微镜（10×100）； 

菌落计数器； 

恒温培养箱； 

恒温干燥箱； 

恒温摇床； 

灭菌锅； 

无菌室或超净工作台； 

酸度计； 

温室或植物光照培养箱：植物叶面光照强度大于8000lx，温度控制范围20-30℃； 

试管：ф15mm×150mm，ф18mm×180mm； 

培养皿：直径9cm； 

三角瓶：500mL； 

无菌吸管：1、2、5、10mL； 

玻璃刮刀； 

滤纸； 

酒精灯； 

标准筛：孔径0.18mm和0.15mm； 

1号羊毛画笔； 

无菌水； 

无离子水。

7.1.2 试剂 

7.1.2.1 革兰氏染色试剂 

结晶紫； 

番红； 

碘液；95%酒精。 

7.1.2.2 根瘤菌琼脂培养基 

甘露醇（C6H14O6）5g 

蔗糖（C12H22O11） 5g 

酵母粉   0.5g 

磷酸氢二钾（K2HPO4）  0.5g 

硫酸镁（MgSO4•7H2O）  0.2g 

氯化纳(NaCl) 0.lg 

硫酸钙(CaS04)0.lg 

钼酸钠(Na2Mn04•2H20) 溶液  lmL 

硫酸锰(MnS04. •4H20) 溶液  1ml 

柠檬酸铁(FeC6H502) l%溶液  1mL 

硼酸(H3B05)  l%溶液1mL 

刚果红(C32H22N606S2Na2) 1%溶液   2.5mL 

琼脂 18~20g 

水  l000mL 

pH值  7.0 

7.1.2.3 马丁培养基(测霉菌数) 

磷酸二氢钾(KH2P04• 7H20)0.5g 

葡萄糖(C6H1206•H20) l0.0g 

硫酸镁(MgS04•7H20)  0.5g 

蛋白胨 5.0g 

1%孟加拉红酒精(无水)溶液  3.3mL 

琼脂 18~20g 

蒸馏水l000mL 

氯霉素 0.lg 

7.1.2.4 豆科植物结瘤试验琼脂斜面培养基 

磷酸二氢钾(KH2P04• 7H20)0.22mg 

氯化钾(KCl)155mg 

硫酸镁(MgS04•7H20)   50mg 

硫酸锌(ZnS04•7H20) 0.25mg 

硫酸铜(CuS04•5H20) 0.25mg 

硼酸(H3B05)0.25mg 

钼酸钠(Na2Mn04•2H20)0.05mg 

柠檬酸铁(FeC6H502)30mg 

硝酸钠(NaN03) 30mg 

琼脂  5~10g 

水   l000mL 

pH7.0 

7.2  成品检验 

7.2.1 气味检验 

取根瘤菌肥料样品打开包装，进行感官检验。

7.2.2 外观检验 

将固体根瘤菌肥料包装打开，装在白色搪瓷盘中，将液体根瘤菌肥料摇匀。在明亮光线下进行感官检验。 

7.2.3 pH值测定 

液体根瘤菌肥料的pH值测定：取供检菌液直接测定pH值，取三次测定结果的平均数。 

固体根瘤菌肥料的pH值测定：取50mL烧杯一个，加入菌肥25g，无离子水25mL。通过磁力搅拌使溶液均匀后用酸度计测定pH值。取三次测定结果的平均数。

7.2.4 含水量测定 

称取固体根瘤菌肥料三份，每份20.00g，精确到0.01g，放入已称恒重的铝盒中。置105℃干燥箱内烘烤4h，移至干燥器内，冷却后称重。根据烘干前后质量差按式(l)计算含水量。取三个样品测定数的平均值。平行样品绝对偏差应低于1%。 

含水量(%)=（m0-m1）/m0×100  ………………(1) 

式中：m0一烘干前样品质量，g 

m1一烘干后样品质量，g。

7.2.5 吸附剂颗粒细度测定 

称样10g(精确至0.01g)，置于标准筛中(直径分别为0.18mm和0.15mm)，用水冲洗，用毛笔轻刷，至粉末不再通过为止。将筛余物置105~110℃温度下烘干，称重。筛余物百分含量按式(2)计算： 

筛余物(%)=筛余物质量/（1-样品含水量百分数）/样品质量×100  ………(2) 

7.2.6 根瘤菌活菌数及杂菌率的测定 

采用平板计数法测定根瘤菌活菌数及杂菌率。

7.2.6.1 制作根瘤菌培养基平板(7.1.2.2)及马丁培养基平板(7.1.2.3) 

7.2.6.2 样品稀释培养 

称取l0g供检样品(精确到0.01g)，装人带玻璃珠及100mL无菌水的三角瓶中(供检样品为液体，则取l0mL加入内装90mL无菌水的三角瓶中)，置摇床振荡20min，转速200r/min。振荡好的样品静置20min后采用10倍稀释法稀释至10-7(液体样品稀释至10-8)。从最后三个浓度悬液中各取0.1mL，加至直径为9cm的培养基平板上，用玻璃刮刀将菌液涂匀。每个稀释度重复三次。25~28℃温度下培养3~7d。用同样方法将10-3稀释度菌悬液0.1mL加到马丁培养基平板上。28℃培养48h。

7.2.6.3 菌落鉴别及计数 

根据被检产品标准描述的菌落特征，鉴别根瘤菌菌落与杂菌菌落。必要时进行革兰氏染色(方法见附录A)、镜检，以区分根瘤菌菌落和其他菌落。取菌落30~300的平板计数。算出三个重复的根瘤菌及杂菌菌落平均数。杂菌是指样品所含有效活菌(包括根瘤菌及促生细菌)以外的其他种类微生物的总称。杂菌总数是马丁培养基上出现的霉菌数与根瘤菌培养基上出现的杂菌数(霉菌除外)之和。

根瘤菌数按式(3)计算，杂菌率按式(4)计算 

根瘤菌数〔亿个/g(mL)〕=菌落平均数×稀释倍数×基础液体积/样品量/加样量  …(3) 

杂菌率(%)=杂菌总数/（根瘤菌数+杂菌总数）×100  ………(4) 

7.2.7 稀释结瘤检验 

寄主植物种子用0.1%升汞溶液表面消毒后催芽，种芽长1~2mm时用供试样品的10-5~10-7稀释度的悬液接种，植于试管琼脂斜面上。设不接种的阴性对照和接种已知菌的阳性对照。重复6次。植物培养温度20~25℃，植物叶面光照强度大于8000lx，每天光照12h。10~20d后观察结瘤状况。如空白对照结瘤，试验需要重做。空白对照不结瘤，正对照结瘤，可以进行判定。在10-6稀释度中70%植株结瘤为稀释结瘤合格。

7.2.8 有效期的检验 

在产品说明书标明的有效期到达前10d测定活菌数，或按产品说明书标明的使用量对寄主进行接种试验(7.2.7)。活菌数达到标准要求或70%植株结瘤为有效期合格。